Sto facendo un esperimento con colture batteriche di E. coli K-12 in terreno LB (Luria-Bertani) per un progetto universitario, ma dopo 24 ore a 37°C nell'incubatore non vedo alcuna crescita significativa. Ho seguito il protocollo passo passo: sterilizzato tutto in autoclave a 121°C per 15 minuti, preparato il terreno con 10g/L di triptone, 5g/L di estratto di lievito e 10g/L di NaCl, pH regolato a 7.0. Ho fatto vari tentativi cambiando il ceppo batterico e controllando la temperatura dell'incubatore, ma le colonie appaiono solo debolmente dopo 48 ore quando dovrebbero essere ben visibili in 18-24 ore. Qualcuno ha esperienza con colture microbiologiche stagnanti? Vorrei capire se è un problema di contaminazione, composizione del terreno o altri fattori prima di cambiare completamente approccio sperimentale.
Perché i miei batteri coltivati non crescono nel terreno di coltura?
Se il terreno LB è preparato correttamente e sterilizzato come dici, il problema potrebbe essere altrove. Hai controllato la vitalità del ceppo batterico prima di inoculare? A volte le colture di E. coli K-12 in laboratorio possono perdere vitalità se non vengono passate regolarmente o se la sospensione madre è vecchia. Inoltre, un dettaglio che spesso si sottovaluta: il pH va misurato *dopo* la sterilizzazione, perché l’autoclave può modificarlo leggermente. Se il pH si sposta troppo, la crescita rallenta o si blocca. Un’altra cosa: hai provato a inoculare in un terreno liquido e non solo su piastra? Potresti vedere se cresce in brodo, e questo ti aiuta a capire se il problema è del terreno solido o generale. Infine, occhio alle condizioni dell’incubatore: anche se dici 37°C, la distribuzione del calore può non essere uniforme, magari la piastra è in una zona più fredda. Se ti va, prova anche un terreno diverso, tipo M9 supplementato, così capisci se il problema è la composizione. Non mollare, questi esperimenti sono una rovina ma anche una scuola di pazienza!
Miguel ha centrato diversi punti fondamentali! Aggiungerei che spesso la qualità dell’acqua usata per preparare il terreno LB può fare la differenza: se usi acqua deionizzata o distillata, meglio evitare l’acqua del rubinetto che potrebbe contenere tracce di cloro o metalli che inibiscono la crescita. Inoltre, la durata della sterilizzazione in autoclave non dovrebbe mai superare i 15-20 minuti, perché un’esposizione troppo lunga può degradare i nutrienti chiave come il triptone e l’estratto di lievito, rendendo il terreno meno favorevole. Un altro dettaglio che ho scoperto per esperienza: la freschezza del terreno è importante, preparalo il giorno stesso o al massimo il giorno prima; se resta troppo a lungo può perdere efficacia. Infine, se le colonie crescono debolmente solo dopo 48 ore, io proverei a fare un controllo della concentrazione iniziale di inoculo, magari è troppo bassa. A volte basta aumentare leggermente la densità per vedere risultati migliori. Non mollare, con un po’ di pazienza si risolve!
Grazie mille @mooreI63, questi dettagli sono preziosissimi! Effettivamente uso acqua del rubinetto e sterilizzo per 25 minuti, probabilmente eccedendo. Non sapevo del degrado dei nutrienti con l'autoclave prolungata.
Proverò subito con acqua distillata e tempi di sterilizzazione ridotti, e preparerò il terreno fresco la mattina stessa dell'esperimento. La densità d'inoculo è un altro ottimo spunto: ho usato una sospensione piuttosto diluita, la prossima volta raddoppio la concentrazione.
Dopo i vostri consigli (tua e di Miguel) ho diversi approcci da testare sistematicamente. Aggiornerò sul risultato!
Proverò subito con acqua distillata e tempi di sterilizzazione ridotti, e preparerò il terreno fresco la mattina stessa dell'esperimento. La densità d'inoculo è un altro ottimo spunto: ho usato una sospensione piuttosto diluita, la prossima volta raddoppio la concentrazione.
Dopo i vostri consigli (tua e di Miguel) ho diversi approcci da testare sistematicamente. Aggiornerò sul risultato!
@fidenziopalmieri Ottimo che hai individuato gli errori chiave! Ma aggiungo due cose che nessuno ha menzionato e che ho visto affossare colture mille volte:
1) **Il raffreddamento del terreno post-sterilizzazione**: se inoculi quando è ancora caldo (anche solo tiepido), stressi i batteri. Aspetta che raggiunga i 37°C *prima* dell'inoculo.
2) **Attenzione al raddoppio della concentrazione d'inoculo**: con E. coli K-12 rischi di saturare troppo presto il terreno. Misura l'OD600 invece di raddoppiare a caso – punta a 0.05-0.1 per iniziare.
Un'altra cosa: controlla come conservi il ceppo master! Se è una coltura stock vecchia o scongelata male, è lì il vero problema. Riparti sempre da una singola colonia fresca su piastra se hai dubbi.
Aggiornaci, sono curiosa di sapere quale correzione ha funzionato! (E se vedi colonie dopo 24h, festeggiamo virtualmente 🎉)
*(PS: odio profondamente l’autoclave sovraccaricata... 20 minuti sono sacri!)*
1) **Il raffreddamento del terreno post-sterilizzazione**: se inoculi quando è ancora caldo (anche solo tiepido), stressi i batteri. Aspetta che raggiunga i 37°C *prima* dell'inoculo.
2) **Attenzione al raddoppio della concentrazione d'inoculo**: con E. coli K-12 rischi di saturare troppo presto il terreno. Misura l'OD600 invece di raddoppiare a caso – punta a 0.05-0.1 per iniziare.
Un'altra cosa: controlla come conservi il ceppo master! Se è una coltura stock vecchia o scongelata male, è lì il vero problema. Riparti sempre da una singola colonia fresca su piastra se hai dubbi.
Aggiornaci, sono curiosa di sapere quale correzione ha funzionato! (E se vedi colonie dopo 24h, festeggiamo virtualmente 🎉)
*(PS: odio profondamente l’autoclave sovraccaricata... 20 minuti sono sacri!)*
@jadecaruso11, hai fatto davvero un'ottima analisi del problema! La questione del raffreddamento del terreno post-sterilizzazione è fondamentale, non ci avevo pensato. Effettivamente, inoculare batteri in un terreno ancora caldo può stressarli e compromettere la crescita. Misurare l'OD600 per determinare la concentrazione d'inoculo è un'altra buona pratica che può fare la differenza. Sono d'accordo anche sulla conservazione del ceppo master: una coltura stock vecchia può essere la causa di molti problemi. Io personalmente ho riscontrato miglioramenti significativi partendo da singole colonie fresche su piastra. Spero che @fidenziopalmieri segua questi consigli e ci aggiorni sui risultati. E, come te, non sopporto l'autoclave sovraccaricata... 20 minuti sono davvero sacri!